Метод дифференциального центрифугированияМетод дифференциального
центрифугирования используется для
фракционирования клеток, т. е. расслоения их
содержимого на фракции в зависимости от удельного
веса различных органоидов и клеточных включений.
В результате центрифугирования компоненты
клеток выпадают в осадок из раствора, располагаясь
в соответствии со своей плотностью. Более плотные
структуры осаждаются при более низких скоростях
центрифугирования, а менее плотные – при высоких
скоростях.

Этапы дифференциального центрифугирования:

Этапы дифференциального центрифугирования:

Центрифугирование в градиенте плотности

Мы как раз начали применять еще новый в то время метод дифференциального центрифугирования. Он сводится к тому, что клетки разрушают в гомогенизаторе, а затем центрифугируют при последовательно возрастающих скоростях, после чего получают несколько фракций, состоящих из разных органелл (рис. 1.) Выделенные таким путем органеллы все еще сохраняют многие из своих функциональных свойств, которые можно затем изучить посредством биохимических методов. Наша задача состояла в том, чтобы установить местонахождение в этих фракциях некоторых ферментов, участвующих в обмене углеводов в печени крысы, и тем самым выяснить, с какими клеточными структурами связаны эти ферменты. Как правило, мы проверяли сначала гомогенат клеток на присутствие данного фермента, а затем искали его во фракциях. Среди прочих ферментов мы работали с так называемой кислой фосфатазой. Этот фермент, отщепляющий неорганический фосфат от ряда фосфорных эфиров, не связан непосредственно с углеводным обменом. В основном он служил нам в качестве контроля.

К нашему удивлению, активность кислой фосфатазы в гомогенате была в 10 раз меньше той величины, которую следовало ожидать на основании предыдущих анализов препаратов, подвергнутых более основательному разрушению в смесителе Уоринга. Суммарная активность всех фракций хотя и превышала вдвое активность гомогената, но все-таки была в 5 раз меньше ожидаемой величины. Когда через пять дней мы повторили определения на тех же фракциях (которые хранили все время в холодильнике), то оказалось, что активность фермента значительно возросла во всех отдельных фракциях, а особенно во фракции, содержащей митохондрии. Теперь суммарная активность уже достигла ожидаемой величины.

К счастью, мы устояли перед искушением отбросить первую серию данных как результат технической ошибки. Мы провели несколько дополнительных опытов и быстро получили ключ к разгадке тайны. В живых клетках фермент в основном (или даже полностью) заключен внутри небольших мешочкоподобных частиц. Поверхностная мембрана этихчастиц не только способна удерживать фермент внутри частицы, но и препятствует проникновению извне тех мелких молекул фосфорных эфиров, с которыми мы работали. Активность, измеренная в наших опытах, характеризовала лишь ту небольшую часть фермента, которая либо находилась в клетке в свободном состоянии, либо освободилась из частиц, поврежденных в ходе опыта. Смеситель Уоринга практически разрушает все частицы; при более мягкой обработке в гомогенизаторе, которую мы применили в наших исследованиях, разрушается лишь около 10% частиц. Этим и объясняется низкая первоначальная активность фермента в гомогенате. Дальнейшее фракционирование приводит к возрастанию суммарной активности во фракциях еще на 10%. Остальная часть фермента освобождается в результате старения частиц при хранении их в течение пяти дней в холодильнике.

TBegin-->TEnd-->

Рис. 1. Дифференциальное центрифугирование позволяет разделить клетки на фракции, состоящие из различных клеточных компонентов. Быстрое механическое вращение пестика разрушает клетки, вызывая освобождение их содержимого в окружающую среду. Гомогенат подвергается последовательному центрифугированию при разных скоростях. Метод, разработанный В. Шнайдером, включает этапы 1—8. Автор и его сотрудники ввели этапы 9 и 10. Фракция митохондрий (6 этап) осаждается после центрифугирования при 25 000 g в течение 10 мин. Числа, характеризующие градиент плотности сахарозы, показывают удельный вес (г/см3).

Дифференциальное центрифугирование

В случае дифференциального центрифугирования образцы центрифугируют определенное время при заданной скорости, после чего удаляют надосадочную жидкость. Этот метод полезен для разделения частиц, сильно различающихся по скорости седиментации. Например, центрифугирование в течение 5--10 мин при 3000-- 5000 д приводит к осаждению интактных бактериальных клеток, тогда как большинство клеточных фрагментов при этом остается в надосадочной жидкости. Фрагменты клеточной стенки и большие мембранные структуры можно осадить центрифугированием при 20 000--50 000 § в течение 20 мин, в то время как маленькие мембранные везикулы и рибосомы требуют для осаждения центрифугирования при 200 000 § в течение 1 ч.

Зональное центрифугирование

Зональное центрифугирование представляет собой эффективный способ разделения структур, имеющих сходную плавучую плотность, но различающихся по форме и массе частиц. В качестве примеров можно привести разделение субъединиц рибосом, различных классов полисом, а также молекул ДНК, имеющих различную форму. Центрифугирование осуществляют либо в бакет-роторах, либо в специально устроенных зональных роторах; для предотвращения конвекции при центрифугировании в стаканах бакет-ротора или в камере зонального ротора создают слабый градиент (обычно сахарозы). Пробу наносят в виде зоны или узкой полосы в самом верху градиентного столбика. Для субклеточных частиц обычно используется градиент сахарозы от 15 до 40% (вес/объем).

Метод дифференциального центрифугирования

Суть метода:

1. Приготовление гомогената из исследуемых клеток;

2. Центрифугирование

3. Разделение фракций

1. Изучение фракций

Принцип метода – в разделении внутриклеточных компонентов на фракции, отличающиеся по массе при помощи высокоскоростной центрифуги.

При подготовке клеток к такому исследованию из клеток готовится гомогенат. Гомогенат – это клетки, которые подвергаются механическому разрушению до состояния взвеси из внутриклеточных структур. Полученные фракции, в дальнейшем можно изучать методами биохимического анализа или изучать морфологию этих структур.

Метод дифференциального центрифугирования рассматривался нами при изучении темы Вакуолярная система клетки, при открытии Де Дювом лизосом и др.

Центрифугирование – первый этап фракционирования, с его помощью разделяются толко достаточно крупные компоненты. Для достижения более высокой степени разделения клеточных компонентов далее используется метод седиментации в градиенте плотности. Эту разновидность метода мы рассматривали в теме, когда касались морфологии рибосом, их субъединиц и рРНК, которые дифференцировали по величине константы седиментации Сведберга.

Для фракционирования отдельных разновидностей белков в биохимии применяется метод хроматографии. В биологии часто используется метод распределительной хроматографии. Суть этого метода заключается в том, что каплю образца (содержащего биологическую жидкость) наносят на поверхность специальной бумаги (хроматография на бумаге) или на пластинку из стекла или пластмассы, покрытую тонким слоем инертного сорбента (целлюлозы или силикагеля) – хроматография в тонком слое или тонкослойная хроматография. Затем пластинку одним концом помещают в смесь растворителей (например воды и спирта). По мере движения растворителя вверх по пластинке его молекулы подхватывают те молекулы образца, которые растворяются. В результате происходит дифференциация молекул образца на хорошо и плохо растворимые, то есть те которые движутся быстро и медленно. Через несколько часов пластинку сушат, окрашивают и определяют на ней местоположение определенных молекул. Другая разновидность разгонки белков – колоночная хроматография. В этом случае смесь молекул образца пропускают через колонку, содержащую твердый пористый матрикс. В результате взаимодействия с матриксом различные белки проходят через колонку с разной скоростью. Этот вид хроматографии, когда используются колонки, набитые крошечными пористыми шариками, находящимися в геле позволяют определить размер белковых молекул.

Биологическое применение

Разнообразные методы хроматографии используются в биологии, например для определения разницы в белках у близких видов (видов-двойников), для которых этот метод является вторым после достаточно трудоемкого кариологического анализа.

Суть этого метода в применении радиоактивных изотопов водорода (трития), серы, фосфора, кислорода и др. и их обнаружения в образце, в который они вводились.

Метод очень чувствительный, так как практически можно зарегистрировать каждый распад, то есть может быть учтен каждый радиоактивный атом.

Принцип метода:

В живую, функционирующую клетку вводятся радиоактивные предшественники, путем очень кратковременного (импульсного мечения). Они включаются в состав определенных клеточных структур. Затем из клеток готовятся микроскопические препараты, на поверхность которых наносится фотоэмульсия. После определенного времени экспозиции в результате радиоактивного распада происходит восстановление серебра фотоэмульсии альфа и бета частицами. После проявления фотоэмульсии, на поверхности препарата видны темные метки, в тех участках, в которые был включен радиоактивный предшественник.

Таким образом, можно наблюдать, как радиоактивная метка перемещается из одной клеточной структуры в другую. Так можно выяснить в каких внутриклеточных структурах может происходить синтез тех или иных веществ.

Если в клетки ввести меченый тритием тимидин, то можно изучать течение во времени процессов, связанных с обновлением (редупликацией ДНК, если в клетку ввести меченый тритием урацил, то можно изучать динамику процессов, связанных с синтезом разнообразных видов молекул РНК, (например, рРНК в ядрышке, иРНК – при транскрибции и т.д.).

Этот метод мы разбирали при изучении разделов об определении времени жизненного цикла клетки и доказательств полуконсервативности редубликации ДНК, при изучении механизма образования экспортного белка.

Период полураспада некоторых радиоактивных изотопов, применяющихся в биологии:

Р32 – 14 сут; J134 – 8.1 сут; S35 – 87 сут; C14 – 5 570 лет; Ca45 – 164 сут; H3 – 12,3 года.